微生物檢驗方法驗證操作中的關鍵問題解析
發布時間：2025-01-13 瀏覽次數：5
來源：環凱轉載于“ 六扇門Study”公眾號，作者~SIXDoors
伴隨GB4789.45的發布和實施，食品實驗室在采用非標方法檢測時越來越重視方法的驗證。不管參照GB4789.45 還是ISO16140-2，還是AOAC通則，驗證過程的關鍵操作環節是必須要清楚的，例如：怎么模擬自然樣本？定性檢測檢出限部分檢出的要求？檢出限和靈敏度的區別？
帶著這些問題，小六翻閱了相關國際標準及GB4789.45的實施指南，抓取重點，分享給大家。
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定性方法驗證中的靈敏度/檢出限驗證，污染水平要求部分檢出？但具體多少算部分？加標部分檢出的濃度要求呢？
不僅在GB 4789.45中有要求，ISO16140-2和AOAC通則中也都有部分檢出水平的要求，理想情況下部分檢出的概率最好是50%，但很難達到，所以對于檢出的概率可以放大到25%~75%，部分檢出時目標菌的濃度一般是在1CFU以下。
AOAC中提到：食品和飲料部分檢出概率濃度一般在0.2-2CFU/樣，檢測概率1.00水平目標濃度在5CFU/樣。環境表面部分檢出概率一般10^4-10^6CFU/表面積。
ISO 16140-2中提到的部分檢出濃度為0.7CFU。
但這些數據也僅僅只能供我們參考，因為檢出水平還受樣品基質，菌群類別特性等多方面因素的影響。
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GB4789.45 對人工污染要求“稀釋液添加到樣品中，不能影響樣品狀態”，如何操作？有相關標準可以參考嗎？
在我們驗證過程中，使用人工污染樣的概率是很大的，許多實驗室操作人工污染時添加稀釋液的比例是比較高的，這對驗證結果是有影響的。因為添加菌液過多是會影響到樣品本身的特性，例如水分，這樣樣品在平衡處理過程中就會受到影響。
那么到底多少的比例可以認為是不會影響樣品的狀態呢？
按照ISO 16140-2中的要求，建議是不超過1%的比例。例如，需要污染的樣品質量是25g,我們染菌的菌液量就不能超過0.25mL。很多實驗室為了方便都添加1mL，這個量其實就有點高了。對于粉末類樣品如果要添加菌粉，添加菌粉的量同樣也是按照不超過1%的比例來操作。
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人工污染樣本制備要考慮微生物受損狀態下的驗證
1.生鮮和冷加工食品接種未處理的微生物；
2.食品一般接種熱損傷后微生物（如50℃ ，加熱10min）要求獲得50%-80%損傷；
3.干燥食品接種凍干培養物。
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充分驗證很重要，大家拿到一份報告怎么看呢？關鍵看哪些點？
一看包容性和排他性
對于有選擇性的項目，如大腸、金葡、沙門等，至少要看有沒有做30株目標菌，30株非目標菌。
二看食品樣品測試數量（準確度-定量，靈敏度-定性）
如果聲稱適用于食品大類，至少包括5個食品大類，每個大類6個樣品（涵蓋3個污染水平），每個樣品一般5個重復，算起來150個樣品測試，兩個方法就是300個測試。
三看相對檢出限驗證（僅定性）
至少3個污染水平，每個接種20個樣品進行測試，總共60個測試。
建議4個污染水平，如：陰性（0CFU/25g）、低濃度（0.1~1 CFU/25g)、中濃度（1~10 CFU/25g）、高濃度（10~100 CFU/25g），以上僅供參考，污染水平也跟食品的限量有關。
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疑問點：關于定性方法的靈敏度和檢出限叫法的解釋
靈敏度體現方法對于樣品中極低污染水平(部分檢出水平)的目標微生物的檢出能力，較高污染水平的樣品對于定性方法的驗證并無太大意義。GB4789.45標準用檢出限來表示定性方法的靈敏度。
小六看到在ISO16140-2中的靈敏度(sensitivity)研究的意思與GB4789.45中不一樣，我們具體來看看！ISO16140-2中的靈敏度研究的目的是確定參考方法和替代方法之間的靈敏度差異。靈敏度研究采用自然污染樣品和(或)人工污染的樣品。需對不同的類別(categories)和類型(types)的樣品進行測試，用接受限進行評價。接受限(最大可接受的差異)取決于該靈敏度研究屬于配對研究或非配研究和測試類別的數量。
這個疑問，小六在GB4789.45-2023《食品安全國家標準 微生物檢驗方法驗證通則》實時指南中找到了答案：國際上微生物檢驗方法驗證中的靈敏度通常指部分檢出水平樣品的陽性符合率。食品安全國家標準微生物檢驗方法沒有參考方法，可以計算陽性率，但是沒有參考的陽性率，無法計算陽性符合率，因此食品安全國家標準微生物檢驗方法無法采用國際上通常使用的靈敏度。
