科研干貨（菌種復蘇與傳代）| 菌種傳代次數必須在五代以內？
發布時間：2024-12-30 瀏覽次數：103
一、菌種傳代次數：經驗值還是理論值？
將菌種的傳代次數控制在5代以內是一項經過長期實踐驗證的經驗結論。這一指導原則的確立，旨在避免多次傳代可能導致菌種遺傳特性喪失或者發生變異。這一變異可能影響其在研究和生產中的穩定性和生物活性。
通過限制傳代次數至5代以內，可以有效減少遺傳變異的風險，從而確保菌種在實驗和生產中保持穩定的遺傳特性及生物活性。這不僅提升了實驗的可靠性，也保障了生產環節的產品質量。嚴格遵循傳代控制要求，不僅是對實驗結果的一種保障，也是對菌種長久穩定利用的責任。因此，這一經驗值在許多專業領域被廣泛認可和應用。
“5代”這一限制既是基于長期微生物學實踐經驗的總結，也具有一定的理論依據。這一傳代次數限制的設立旨在避免由于過多傳代導致的菌種退化或遺傳變異，從而確保在研究和生產中所使用的菌種保持其穩定的遺傳特性和生物活性。
這一數字并非隨意制定，而是依托大量實驗數據和實踐經驗，認為5代是一個合理的上限，能夠有效維持菌種的穩定性和可靠性。在許多生物技術應用中，遵循這項傳代限制已經成為確保實驗和生產一致性的重要保障。通過嚴控傳代次數，科學家可以更大程度地確保結果的可重復性和產品的高質量。
二、菌種傳代次數必須在5代以內？超過5代是否可行？
根據微生物學常識，菌種的傳代次數與其遺傳變異率之間存在正相關關系：傳代次數越多，變異的風險也就越高。雖然技術上并非完全禁止使用超過5代的菌種，但在超過5代后，菌種的穩定性和可靠性可能會受到挑戰，增加意外問題出現的可能性。
只有在經過5代傳代后，經過細致檢查確認菌種的形態結構、生理生化特性等依然保持不變的情況下，才可考慮繼續使用。但即便如此，多個傳代在實驗過程中仍然被不建議，因為這會顯著增加變異和風險的可能性，這在實驗及生產中被視為一種風險行為。因此，嚴格控制菌種傳代在5代以內是基于豐富的實踐經驗總結而來的最佳實踐方法，以確保實驗和生產流程在準確性和可靠性上保持不變。堅持這一經驗法則不僅是在保證實驗結果的一致性，更是在規避不必要的研究風險。
三、限制傳代次數依據是什么？
根據《中國藥典：2020年版·四部-9203藥品微生物實驗室質量管理指導原則》，該標準規定，工作菌株的傳代次數應嚴格控制在不超過5代以內。起始代數為從菌種保藏機構獲得的標準菌株，計為第0代。這一規定的設置旨在防范多次傳代所可能導致的菌種遺傳變異風險。
在具體操作中，一次傳代被定義為將活的培養物接種到新的微生物生長培養基中進行培養。無論形式如何，任何轉種操作均被視為一次傳代。為了確保實驗結果的準確性和可靠性，實驗室在有必要時需對工作菌株的特性和純度加以確認。
在實踐中，標準菌株被視為第0代，而其衍生的標準儲備菌株為第1代，隨后的儲備菌株為第2代（儲備菌株亦可作為工作菌株使用）。這意味著，工作菌株的第1代W1實際上相當于第2代菌株。根據“不超過5代”的規定，工作菌株可用的傳代代數實際為W1、W2、W3和W4。在此之后，繼續傳代將會大大增加菌種發生變異的幾率，因此不建議進行超限傳代。
四、如何妥善保藏菌種？
根據《中國藥典：2020年版·四部-9203藥品微生物實驗室質量管理指導原則》，建議采用低溫冷凍干燥、液氮貯存或超低溫冷凍（低于-30°C）等方法來保存菌種。這些方法能夠有效延長菌種的保存時間，尤其是低于-70°C的冷凍方式或冷凍干燥技術。此外，標準儲備菌株可以用于每月或每周一次的轉種，以制備工作菌株。
需要特別注意的是，一旦冷凍菌種被解凍并用于制備工作菌株后，不得再重新冷凍或再次使用原凍存管。這是為了確保菌種的穩定性和純度不會受到不必要的影響。因此，除了嚴格控制傳代次數在5代以內以減少變異風險之外，還必須遵循適當的菌種保存方法，以確保菌種的質量和實驗結果的可靠性。
五、實際操作中，如何確認是那一代菌種？
①. 在實際實驗室環境中，有些實驗室對菌種管理極為嚴格，而另一些實驗室可能顯得較為混亂。由于實驗的人員頻繁更替和菌種的頻繁使用，有時會出現難以追蹤菌種代數的問題。面對這種普遍現象，我們只能以收到的菌種作為基礎，將其視為第0代。
②. 當接收到新的菌種時，我們首先需要進行簡單的形態學鑒定以及生理生化特性檢測，以評估菌株的活力。如果這些指標沒有問題，那么該菌種可以被視為F0，即母代菌種。但需要明確的是，這樣的做法并不符合《中國藥典》中規定的標準第0代菌種。
③. 這種方法僅作為臨時參考，并不適用于嚴格要求的實驗環境。為了確保實驗的穩定性和可靠性，還是應盡力遵循規定的實驗菌種管理流程，標準化菌種的保存和使用，以避免在傳代過程中出現更多不確定性。
六、菌種復蘇與傳代
1. 復蘇：在無菌環境中打開冷凍干燥菌種管，加入適量的培養液。培養液的選擇應根據菌種的特性進行，如細菌使用營養肉湯，白色念珠菌使用沙堡液體培養基，分枝桿菌使用蘇通綜合液體培養基，而黑曲霉菌則使用麥芽浸膏營養肉湯培養基。通過幾次上下吸吹的方式，使菌種充分融化并分散。之后，將菌種懸液適量滴入含有5.0 mL～10.0 mL相應培養液的試管中，并在適宜溫度下培養至規定時間。通常條件為36℃±1℃培養18 h～24 h，而黑曲霉菌則需要在30℃±1℃培養42 h～48 h，此過程產出的是第1代培養物。
2. 傳代至第2代：利用接種環從第1代培養物中取樣，或直接從冷凍保存的菌種管中取出適量菌液或瓷珠，將其劃線接種于適合的培養基平板。根據不同的菌種，選擇適宜的培養基。例如，細菌使用營養瓊脂培養基，白色念珠菌使用沙堡瓊脂培養基，分枝桿菌使用改良羅氏培養基或其他專用復合瓊脂培養基，黑曲霉菌使用麥芽浸膏瓊脂培養基。在適宜溫度下培養至規定時間，即為第2代培養物。
3. 傳代至第3代：選取第2代培養物中的典型菌落，接種于相應的培養基斜面或平板。培育條件同樣依據菌種進行選擇。如需可用：細菌使用營養瓊脂斜面，白色念珠菌用沙堡瓊脂斜面，分枝桿菌則用改良羅氏菌培養基或專用復合瓊脂斜面，黑曲霉使用麥芽浸膏瓊脂培養基平板。這一過程得到第3代培養物。
4. 傳代至第4代：從第3代培養物取樣，接種在合適的培養基斜面，在適宜溫度下培養，直至達到期望的時間并形成第4代培養物。
5. 傳代記錄：繼續傳至所需代數時，需在傳代試管上明確標記菌種名稱、菌種編號、代數及傳代日期等基本信息，以便追蹤和管理菌種傳代過程的準確性。
文章來源：環凱（官網：huankai.com）轉載于“ Dr實驗助手 ”公眾號；原作者~ 實驗軼。
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