食品混樣檢測沙門氏菌，采用不同方法驗證其準確性和一致性
發布時間：2024-12-25 瀏覽次數：136
來源：環凱轉載于“ 六扇門Study”公眾號，作者~SIXDoors
近期在研究混樣檢測可行性時，小六查詢到一篇關于食品中沙門氏菌混樣檢測方法的驗證的文章《Validation of test portion pooling for Salmonella spp. detection infoods》，摘錄部分重點內容跟大家分享。
這個實驗是為證明不同食品基質中沙門氏菌檢測，混樣（最大375g）增菌檢測與參考的25 g單獨增菌檢測方法是否存在等效性。比較不同食品基質，不同檢驗方法（培養 、ELISA和RealTime PCR）在檢出概率為50%時的檢測限(LOD50)。
驗證規則：
選擇了6大類食品樣本，23種不同的食品基質（根據ISO 16140-2：2016附件A中選擇），基本可涵蓋全球范圍內的食品類別。
每種食品基質共測試40個重復。制備了20個單個測試部分(25g參考樣本量）和20個混合試測試部分(375g替代樣本量），三個接種水平（低、中、高），每個接種水平做2個重復。
驗證方案
菌株添加、操作流程等
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1、菌株添加
不同食品基質中添加的沙門氏菌血清型如下表。
不同菌株分別從冷凍培養液中轉移并培養。
用于接種不同基質的菌株需要提前模擬亞致死狀態操作，即：50°C的水浴中孵育10分鐘。通過比較選擇性瓊脂（XLD培養基）上的菌落數量（CFU）與非選擇性瓊脂（TSA培養基）上的菌落數量（CFU），估算菌株熱損傷程度。
熱損傷程度在43%~68%之間，與ISO 16140-2：2016要求一致。
2、實驗操作
將375g混合樣本和25個單獨樣本，分別加到3375mL和225mLBPW（已經提前預熱到37°C）中，均質2min。在37°C±1°C中培養，16h至24h（時間長短取決于不同方法）。
注意：對于含有益生菌的食品，需將10 mg萬古霉素溶解于10 ml無菌水中 使用0.22μm的過濾膜進行過濾后，將10ml的萬古霉素原液加入到1000 ml的BPW中。
方法1:培養法，參照 ISO 6579:2002，
前增菌培養16 h-20 h后，使用RVS進行選擇性增菌，20h-24h后進行平板分離，測定菌落濃度。
整體時間預計：（16 h-20 h）+（20h-24h）+（18 h-24 h）
方法2:GDS法，專有方法
前增菌培養16 h-20 h后，進行磁珠富集和熒光PCR檢測。
整體時間預計：（16 h-20 h）+（2h-2h）+（1.0h-1.5h）
方法3:TPSG法，專有方法
前增菌培養16 h-20 h后，使用RVS進行選擇性增菌，之后用ELISA試劑盒檢測。
整體時間預計：（16 h-20 h）+（18h-24h）+（1.0h-1.5h）
方法4:VIDAS ICS-SLM法，專有方法
前增菌培養18 h-24 h后，使用VIDAS中進行自動免疫濃縮，在41.5±1.5°C下繼續培養5-6h后，采用VIDAS進行自動檢測。
整體時間預計：（18 h-24 h）+（5h-6h）+（1.0h-1.5h）
方法5:VIDAS Easy SLM法，專有方法
前增菌培養16 h和22 h后，使用專用培養基，在41.5±1.5°C下孵育22 h -26 h，之后采用VIDAS進行自動檢測。
整體時間預計：（16 h-22 h）+（22h-26h）+（1.0h-1.5h）
不同檢驗方法前增菌培養時間要求如下表：
專有檢驗方法，已被驗證過的檢出限如下表：
結果分析
檢出限、檢出率
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1、不同方法檢出限測試結果
采用最長增菌時間培養方案進行測試，23種食品基質種有21種測下下來，RLOD50 < 2.5，是可以接受的。
在所有測試方法和條件下，只有一種食品（N° 19巧克力醬）結果不佳，可能與含有抑菌成分有關，還需要進一步研究。
2、最長和最短前增菌時間的研究
為了研究最短和最長前增菌時間對混樣及單個測試結果的影響，實驗對每種方法和食品基質都進行了LOD50測試。對25 g樣品進行的460個計算，有15個在最短和最長前增菌時間后的LOD50值均為>1 MPN。然而在最短前增菌時間時，混樣增菌的LOD50>1 MPN的兩倍（如下圖），顯然，當使用最短的前增菌時間時，混合樣本的LOD50更高。
與 25 g單一測試相比，375 g混樣測試的最短和最長預增菌培養時間的 LOD50 值不同，這可能是因為某些食品微生物生長受阻有關。
事實上，假設微生物在前增菌的培養液中隨機分布，“為了確保在1ml預增菌培養物中至少可被轉移1個目標菌，要求每ml培養物中至少平均存在7個活菌。” (Jarvis, 2007)。
考慮到沙門氏菌在37°C下的最大指數生長期μ = 0.8-0.9 log cfu/ml/h（Juneja和Marks，2006，Zheng等人，2013），混合樣品（375 g在3.750 L）將比（25 g在225mL）至少需要多培養1.3h-1.5h，才能達到大致相同的濃度。
這種差異可能會對亞致死熱處理損傷的沙門氏菌的假陽性率產生很大影響，其中滯后期可能大于4h (Juneja and Marks, 2006)，并且對于存在背景菌群或抑制劑的樣品也是如此。
3、不同方法陽性檢出率結果
前增菌24h后（最長時間），測定了沙門氏菌的檢出水平（log10cfu/ml）。結果表明，在5 log10 cfu/ml的水平下，測試方法均可檢出（95%為陽性） ，在濃度為3 log10 cfu/ml的情況下，無論方法如何，82%的樣品檢測出沙門氏菌陽性。
實驗結論
??對于多種食品基質，375g混樣增菌后，無論采用何種檢測技術，LOD50結果是可接受的，并且與25g單檢和375 g混樣，經過驗證具有很好的一致性。
??在所有測試的方法和條件下，只有一種食品（N° 19巧克力醬）結果不佳，可能與含有抑制成分有關，還需要進一步研究。
??前增菌培養的時間越長，檢測結果表現出更好（具有高LOD50的基質數量較少）。
??前增菌后沙門氏菌的最終濃度對不同方法的陽性檢出率沒有較大影響。
