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GB4789.12-2016 肉毒梭菌及肉毒素檢驗

發布時間：2024-06-28      瀏覽次數：1200    分享：

肉毒梭菌檢驗的衛生學意義

產生的神經麻痹毒素（肉毒毒素），可引起人和動物中毒，依據其毒素不同，將其分為7種不同的型

分類

可引起中毒的肉毒梭菌型

引起人群中毒

A、B、E、F(只發生于丹麥與美國)

引起畜、禽中毒

C（α、β）、D

未知

G

A、B型分布最廣，土壤，水底均有發現，C、D多存在于動物尸體，E多存在于海洋沉積物中（菌體與芽孢均適應于深水低溫）

臨床：常見于豆谷類的發酵食品，如臭豆腐，豆瓣醬，豆豉等。臘肉，香腸等熏制食品發現的較少。

潛伏期（與攝入毒素量，毒力和個體的狀態有關）

    國外報到多為12-36h

    國內最短6h，最長60h

癥狀與體征（主要癥狀都是神經麻痹的表現）

    非特異性的刺激：頭暈，頭疼，惡心；甚至嘔吐，腹瀉

    肉毒特有癥狀：視力減弱，全身無力，語言困難，呼吸困難（直接死因），但神志清醒

由于其生長特性，家庭制的發酵食品比較容易成為肉毒梭菌的產生環境。

肉毒梭菌的生物學特性

形態與染色：

? 厭氧性桿狀菌，新鮮培養的革蘭氏為陽性，多形態性細菌（直桿狀/稍彎曲）。4~8根周生鞭毛，行動遲緩，沒有莢膜。

? 形成芽孢，芽孢比繁殖體寬，卵圓形，位于次級端，或偶位于中央，常見游離芽孢。

培養特性：

? 固體培養基上形成3mm左右，非正圓形，表面顆粒狀，邊緣不整齊，界限不明顯、絨毛網狀，向外擴散。

? 厭氧。

? 生長溫度25-35°C，生長pH 6.0~8.2。

? 卵黃平板上有乳濁環，表面有彩虹薄層。

? 卵黃平板上有乳濁環，表面有彩虹薄層。肉毒梭菌的生化性狀很不規律，即使同型，也常常見到株間差異。

肉毒毒素：

肉毒毒素的毒性極強，是最強的神經麻痹毒素之一，1克毒素能殺死400萬噸小白鼠，一個人的致死量不會大于2微克。但需要注意的是不同物種對不同毒素的敏感性不同。

肉毒毒素為外毒素，有文獻表明其毒素由菌體表面產生，在菌體成熟或崩解后釋放于環境中。

本身為大分子蛋白，引起人群中毒的A,B,E三種都可分為兩個蛋白成分：一個具有神經毒性，一個為無毒性的血凝素。、

部分肉毒毒素有被激活的性質：在腸道中被胰酶激活，導致毒性大幅度提升（常見于E型毒素）

對許多理化作用是比較不穩定的

耐熱：A型60℃，2分鐘加熱，差不多完全破壞，B，E，二型要70℃ 2分鐘加熱才能完全破壞，而C型需要90℃ 2分鐘D型需要70℃40分鐘。

pH：耐酸而不耐堿。

肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗

一個是毒素檢出（更為重要，只有檢出有毒素，才能做出肯定性結論），一個是細菌鑒定。（時間較長，延誤治療時機）

患者血清是最好的檢樣，但要獲得可供做出診斷的血清，需要看中毒的程度如何和采血的時間是否合適。

食剩的可疑食品

不得已的情況下，也可采用患者嘔吐物或者胃液。

肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗程序


1、增菌培養

◆ 5.3.1 增菌培養與檢出試驗

◆ 5.3.1.1 取出庖肉培養基4支和TPGY 肉湯管2支，隔水煮沸10min~15min，排除溶解氧,迅速冷卻，切勿搖動，在TPGY 肉湯管中緩慢加入胰酶液至液體石蠟液面下肉湯中，每支1 mL，制備成TPGYT。

◆ 5.3.1.2 吸取樣品勻液或毒素制備過程中的離心沉淀懸浮液2mL接種至庖肉培養基中，每份樣品接種4支，2支直接放置35℃±1℃厭氧培養至5d，另2支放80℃保溫10min，再放置35℃±1℃厭氧培養至5d；同樣方法接種2支TPGYT肉湯管，28℃±1℃厭氧培養至5d。

◆ 注：接種時，用無菌吸管輕輕吸取樣品勻液或離心沉淀懸浮液，將吸管口小心插入肉湯管底部，緩緩放出樣液至肉湯中，切勿攪動或吹氣。

5.3.1.3 檢查記錄增菌培養物的濁度、產氣、肉渣顆粒消化情況，并注意氣味。肉毒梭菌培養物為產氣、肉湯渾濁(庖肉培養基中A 型和B型肉毒梭菌肉湯變黑)、消化或不消化肉粒、有異臭味。

5.3.1.4 取增菌培養物進行革蘭氏染色鏡檢，觀察菌體形態，注意是否有芽胞、芽胞的相對比例、芽胞在細胞內的位置。

5.3.1.5 若增菌培養物5d無菌生長，應延長培養至10d，觀察生長情況。

5.3.1.6 取增菌培養物陽性管的上清液，按5.2方法進行毒素檢出和確證試驗，必要時進行定型試驗，陽性結果可證明樣品中有肉毒梭菌存在。

注：TPGYT增菌液的毒素試驗無需添加胰酶處理。

2、分離培養

◆ 5.3.2.1 增菌液前處理，吸取1mL增菌液至無菌螺旋帽試管中，加入等體積過濾除菌的無水乙醇，混勻，在室溫下放置1h。

◆ 5.3.2.2 取增菌培養物和經乙醇處理的增菌液分別劃線接種至卵黃瓊脂平板，35 ℃±1 ℃厭氧培養48h。

◆ 5.3.2.3 觀察平板培養物菌落形態，肉毒梭菌菌落隆起或扁平、光滑或粗糙，易成蔓延生長，邊緣不規則，在菌落周圍形成乳色沉淀暈圈(E型較寬，A 型和B型較窄)，在斜視光下觀察，菌落表面呈現珍珠樣虹彩，這種光澤區可隨蔓延生長擴散到不規則邊緣區外的暈圈。

◆ 5.3.2.4 菌株純化培養，在分離培養平板上選擇5個肉毒梭菌可疑菌落，分別接種卵黃瓊脂平板，35℃±1℃，厭氧培養48h，按5.3.2.3觀察菌落形態及其純度。

梭狀芽孢桿菌在卵黃瓊脂上形態

3、鑒定實驗

◆ 5.3.3 鑒定實驗

◆ 5.3.3.1 染色鏡檢

挑取可疑菌落進行涂片、革蘭氏染色和鏡檢，肉毒梭菌菌體形態為革蘭氏陽性粗大桿菌、芽胞卵圓形、大于菌體、位于次端,菌體呈網球拍狀。

◆ 5.3.3.2 毒素基因檢測

4、毒素基因檢測

a）菌株活化：挑取可疑菌落或待鑒定菌株接種TPGY，35℃±1℃厭氧培養24h。

b）DNA 模板制備：

◆ 吸取TPGY培養液1.4 mL至無菌離心管中，

◆ 14000×g 離心2 min，棄上清，

◆ 加入1.0 mL BS懸浮菌體，

◆ 14000×g 離心2 min，棄上清，

◆ 用400μL PBS重懸沉淀，

◆ 加入10 mg/mL 溶菌酶溶液100 μL，搖勻，37 ℃水浴15 min，

◆ 加入10 mg/mL 蛋白酶K 溶液10 μL，搖勻，60 ℃水浴1h，再沸水浴10 min，

◆ 14000×g 離心2 min，上清液轉移至無菌小離心管中，

◆ 加入3 mol/L NaAc溶液50 μL和95%乙醇1.0 mL，搖勻，-70 ℃ 或 -20 ℃ 放置30 min，

◆ 14000×g 離心10 min，棄去上清液，

◆ 沉淀干燥后溶于200 μL TE緩沖液，置于-20 ℃保存備用。

◆ 注：根據實驗室實際情況，也可采用常規水煮沸法或商品化試劑盒制備DNA模板。

c）核酸濃度測定(必要時)：

◆ 取5μLDNA 模板溶液，加超純水稀釋至1mL，

◆ 用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計分別檢測 260nm 和 280nm 波段的吸光值A260和A280。按式(1)計算DNA濃度。

◆ 當濃度在0.34μg/mL—340μg/mL或A260/A280比值在1.7—1.9之間時，適宜于PCR擴增。

C ——— DNA 濃度,單位為微克每毫升(μg/mL)；

A260 —— 260nm 處的吸光值；

N ——— 核酸稀釋倍數。

d）PCR擴增：

1) 分別采用針對各型肉毒梭菌毒素基因設計的特異性引物(見表1)進行PCR擴增，包括

● A型肉毒毒素(botulinumneurotoxinA，bont/A)、

● B型肉毒毒素(botulinumneurotoxinB，bont/B)、

● E型肉毒毒素(botulinumneurotoxinE，bont/E)、

● F型肉毒毒素(botulinumneurotoxinF，bont/F)

每個PCR反應管檢測一種型別的肉毒梭菌。

2) 反應體系配制見表2，反應體系中各試劑的量可根據具體情況或不同的反應總體積進行相應調整。


3) 反應程序，預變性95℃、5min；循環參數94℃、1min，60℃、1min，72℃、1min；循環數40；后延伸72℃，10min；4℃保存備用。

4) PCR擴增體系應設置陽性對照、陰性對照和空白對照。用含有已知肉毒梭菌菌株或含肉毒毒素基因的質控品作陽性對照、非肉毒梭菌基因組DNA 作陰性對照、無菌水作空白對照。

e）凝膠電泳檢測PCR擴增產物：

◆ 用0.5×TBE緩沖液配制1.2%—1.5%的瓊脂糖凝膠，凝膠加熱融化后冷卻至60℃左右加入溴化乙錠至0.5μg/mL或Goldview5μL/100mL制備膠塊，

◆ 取10μL PCR擴增產物與2.0μL 6×加樣緩沖液混合，點樣，其中一孔加入DNA 分子量標準。0.5×TBE電泳緩沖液，10V/cm 恒壓電泳。

◆ 根據溴酚藍的移動位置確定電泳時間,用紫外檢測儀或凝膠成像系統觀察和記錄結果。

PCR擴增產物也可采用毛細管電泳儀進行檢測。

f）結果判定：

◆ 陰性對照和空白對照均未出現條帶，陽性對照出現預期大小的擴增條帶(見表1)，判定本次PCR檢測成立；

◆ 待測樣品出現預期大小的擴增條帶，判定為PCR結果陽性，根據表1判定肉毒梭菌菌株型別，待測樣品未出現預期大小的擴增條帶，判定PCR結果為陰性。

注：PCR試驗環境條件和過程控制應參照GB/T27403《實驗室質量控制規范 食品分子生物學檢測》規定執行。

肉毒梭菌 E/ F 型毒素基因PCR 檢測試劑盒（KJD07P）

? 產品組成：

組分名稱

規格×數量

凍干試劑

8 管 × 3 排

復溶液

1 mL × 1 管

陽性對照

1管(凍干型)

陰性對照

1管(凍干型)

裂解液

1 mL × 1 管

超純水

1 mL × 1 管

6 × Loading buffer

240 μL × 1 管

說明書

1份

◆ 5.3.3.3 菌株產毒試驗

● 將PCR陽性菌株或可疑肉毒梭菌菌株接種庖肉培養基或TPGYT 肉湯(用于E型肉毒梭菌)，按5.3.1.2條件厭氧培養5d，按5.2方法進行毒素檢測和(或)定型試驗，毒素確證試驗陽性者,判定為肉毒梭菌，根據定型試驗結果判定肉毒梭菌型別。

● 注：根據PCR陽性菌株型別，可直接用相應型別的肉毒毒素診斷血清進行確證試驗。

4、毒素檢測

◆ 5.2.1毒素液制備

取樣品勻液約40mL或均勻液體樣品25mL放入離心管，3000 r/min離心10min~20min，收集上清液分為兩份放入無菌試管中，一份直接用于毒素檢測，一份用于胰酶處理后進行毒素檢測。液體樣品保留底部沉淀及液體約12mL，重懸，制備沉淀懸浮液備用。

胰酶處理：用1mol/L氫氧化鈉或1mol/L鹽酸調節上清液pH 至6.2，按9份上清液加1份10%胰酶(活力1∶250)水溶液，混勻，37℃孵育60min，期間間或輕輕搖動反應液。

◆ 5.2.2檢出試驗

用5號針頭注射器分別取離心上清液和胰酶處理上清液腹腔注射小鼠3只，每只0.5mL，觀察和記錄小鼠48h內的中毒表現。典型肉毒毒素中毒癥狀多在24h內出現，通常在6h內發病和死亡，其主要表現為豎毛、四肢癱軟，呼吸困難，呈現風箱式呼吸、腰腹部凹陷、宛如峰腰，多因呼吸衰竭而死亡，可初步判定為肉毒毒素所致。若小鼠在24h后發病或死亡，應仔細觀察小鼠癥狀，必要時濃縮上清液重復試驗，以排除肉毒毒素中毒。若小鼠出現猝死(30min內)導致癥狀不明顯時，應將毒素上清液進行適當稀釋，重復試驗。

注：毒素檢測動物試驗應遵循GB15193.2《食品安全國家標準 食品毒理學實驗室操作規范》的規定。

◆ 5.2.3確證試驗

上清液或(和)胰酶處理上清液的毒素試驗陽性者,取相應試驗液3份,每份0.5mL，其中

● 第一份加等量多型混合肉毒毒素診斷血清，混勻，37℃孵育30min；

● 第二份加等量明膠磷酸鹽緩沖液,混勻后煮沸10min；

● 第三份加等量明膠磷酸鹽緩沖液，混勻。

將三份混合液分別腹腔注射小鼠各兩只，每只0.5mL，觀察96h內小鼠的中毒和死亡情況。

結果判定：若注射第一份和第二份混合液的小鼠未死亡，而第三份混合液小鼠發病死亡，并出現肉毒毒素中毒的特有癥狀，則判定檢測樣品中檢出肉毒毒素。

結論

狀況分類

肉毒毒素

第一份和第二份未死亡，第三份死亡，并出現肉毒毒素中毒的特有癥狀，

有其他易熱性毒素，也可能是肉毒毒力過強，需要稀釋

第一份死亡，第二份未死亡，第三份死亡

細菌性外毒素以外的毒素或毒物

第一份，第二份，第三份都死亡

無毒素，或稀釋過度

都未死亡

結果報告

◆ 6.1肉毒毒素檢測結果報告

● 根據5.2.2和5.2.3試驗結果，報告25g(mL)樣品中檢出或未檢出肉毒毒素。

● 根據5.2.5定型試驗結果，報告25g(mL)樣品中檢出某型肉毒毒素。

◆ 6.2肉毒梭菌檢驗結果報告

● 根據5.3各項試驗結果，報告樣品中檢出或未檢出肉毒梭菌或檢出某型肉毒梭菌。

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